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超高通量基因合成鉴定肿瘤抗原特异性TCR新技术
T 细胞受体 (TCR) 基因疗法是细胞免疫疗法的一种有效形式，其中患者 T 细胞经过基因工程改造，以表达具有明确肿瘤反应性的 TCR。 然而，由于患者 T 细胞库中肿瘤特异性 T 细胞普遍缺乏，以及肿瘤上表达的 T 细胞表位具有患者特异性，因此治疗性 TCR 的分离变得复杂。近日，荷兰癌症研究所的Wouter Scheper等在Nature Biotechnology杂志发表了Discovery of tumor-reactive T cell receptors by massively parallel library synthesis and screening文章，报道了一种高通量、个性化的TCR鉴定技术，能够在一个体系中中组装合成TCR文库，经报告T细胞表达，通过患者来源的肿瘤细胞或抗原呈递细胞进行功能性筛选。通过此方法，从多个患者的肿瘤浸润性T淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocyte, TIL）中筛选出数千个TCR，并鉴定出数十个具有强肿瘤反应性的CD4+和CD8+ T细胞来源的TCR，其中包括可识别患者特定新抗原的TCR。
研究人员利用超高通量TCR基因合成将编码各个TCR的CDR3Jα和CDR3Jβ序列的片段制备为单独的单链DNA（ssDNA）寡核苷酸池。这些池中的每个寡核苷酸都包含独特的正交杂交序列（Zip），其中Zip序列能够以极高的保真度进行片段组装，确保实现各个TCR的CDR3Jα和CDR3Jβ寡核苷酸的正确配对。此外，还包括大约20个核苷酸连接器序列（ConnA和ConnB），用于指导CDR3Jα和CDR3Jβ寡核苷酸分别与相关种系TRAV和TRBV等位基因配对。通过多步组装过程，该方法可以产生了一个TCR亚文库，其中每个分子都由与TCR特异性Zip序列耦合的TRBV、TRBC和TRAV结构域（称为"VCV"片段）组成。然后将TCR亚文库到克隆到下游包含TRAC结构域的表达载体中，形成完整的TCR文库。NGS测序分析在概念验证上证明这种新方法，一个反应中可合成多达1,000个特异性的TCR。
TCR基因组装流程（图片来源：Nature Biotechnology）
进一步为了确定该方法的可行性，对黑色素瘤患者NKIRTIL063的肿瘤CD8+TIL进行了单细胞TCR测序，并设计和合成了个性化的TCR文库，该文库编码所有已鉴定的TCR (4542个测序的CD8+TIL中有928个TCR)。此外，文库中还收录了几个针对常见TAA且具有不同亲和力的HLA-A*02:01限制性TCRs作为内对照，NKIRTIL063 TCR文库被逆转录病毒转化到CD8+Jurkat细胞（图2a）。 为了评估该筛选方法的灵敏性，这里首先利用所包含的对照TCRs，并评估了以MART1（EAAGIGILTV）特异性模型TCR DMF4和DMF5或WT1（RMFPNAPYL）特异性TCR C4和C4DLT的同源多肽脉冲的HLA-A*02:01阳性永生化B细胞系的筛选性能，通过流式细胞术（FACS）分离激活的T细胞或基于激活标记表面表达的磁激活细胞分选（MACS），然后通过PCR扩增分离细胞的转基因TCR，并使用NGS进行定量。与MART1肽负载细胞孵育后，激活的T细胞中TCR DMF4和DMF5明显富集，而WT1肽负载细胞的反应则富集了TCR C4和C4DLT（图2b）。值得注意的是，与低亲和力的DMF4和C4 TCR相比，高亲和力的DMF5和C4DLT TCR表现出更明显的富集，表明T细胞-靶细胞相互作用的强度可以通过筛选数据来评估。
接下来，为了评估筛选平台对发现MHC II限制性TCR的适用性，合成了一个包含1341个TCR的文库，该文库编码从卵巢肿瘤OVC190分离的CD4+TIL的单细胞测序确定的所有TCR，并在CD4+Jurkat细胞中表达该文库。两个以前从黑色素瘤患者的TIL中分离出来的MHC II限制性新抗原特异性TCR被纳入该文库作为内对照。对用两个对照TCR的任一同源多肽脉冲的患者匹配的永生化B细胞进行筛选表明，两个新抗原特异性TCR对其同源新抗原的反应具有明显且唯一的富集。鉴于单个TCR的丰度在合成文库中可能会有所不同，还评估了该筛选方法在抗原特异性TCR出现频率低于平均水平的情况下的敏感性。为此，将表达NKIRTIL063文库的Jurkat细胞与未转导细胞混合，使得单个NKIRTIL063 TCR的平均出现频率为1×10-3、0.3×10-3、1×10-4或0.3×10-4细胞总数。针对MART1肽负载的B细胞筛选，清楚地识别出两种MART1特异性TCR，包括低亲和力DMF4 TCR。因此该方法允许人们区分不同亲和力的TCR，并筛选MHC I类限制性和MHC II类限制性TCR。
为了评估该方法的TCR筛选方法对治疗相关TCR进行个性化鉴定的可行性，接下来在NKIRTIL063库中寻找肿瘤特异性TCR。先以抗原不可知的方式广泛调查患者库中的抗肿瘤谱系。因此，对与患者NKIRTIL063共享HLA-A*02:01的两个同种异体黑色素瘤细胞系进行了TCR文库的筛选, 成功筛选出针对细胞系RPMI7951和Malme3M的数十个富集的TCR，其中31个对Malme3M细胞的MHC I类依赖性识别。并进一步对另一名宫颈癌患者CV19的中TIL衍生的TCR的肿瘤反应性进行了分析，针对患者6种MHC I修饰后的SiHa细胞筛选文库，鉴定出34个有反应的TCR。对表达HPV E7或E6细胞的筛选显示，3个TCR对E7具有反应性）。值得注意的是，用SiHa反应性而非HPV E7反应性TCR改造的T细胞能够识别患者的自体肿瘤消化物(图4 g)。
研究人员鉴定了黑色素瘤患者NKIRTIL063的非同义肿瘤突变，并设计和表达了串联小基因(TMG)构建体，将所得20个表达TMG的B细胞系合并为5个库，用于筛选患者TCR文库。共筛选出32个富集的TCR，并证实了32个TCR中的22个（69％）针对TMG3、7、8和16具有反应性。TMG解析后并最终确定了四种新抗原（GFPT2 A676V、CCSER P329L、TNFAIP2 P348A和ADAM10 P164L）作为筛选识别的TCR的同源靶标。为了评估了在肿瘤特异性TIL的频率较低的冷肿瘤中鉴定针对新抗原特异性TCR，从而还研究了卵巢癌患者OVC190。在卵巢癌患者OVC190中找到了3种的新抗原反应性TCR，这些TCR均识别MTREX D398A新抗原。TCR工程化改造后的CD4+T细胞对表达MTREX D398A的B细胞显示出细胞毒性，但对表达野生型MTREX序列的细胞没有细胞毒性。在该患者肿瘤中CD8+TIL来源的TCR中未发现新抗原特异性TCR。
综上所述，肿瘤抗原特异性TCR筛选技术可用于发现个性化肿瘤特异性和新抗原特异性TCR，并应用于治疗肿瘤特异性TIL通常很少见的癌症患者。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41587-024-02210-6
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